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当存在原型间隔区相邻基序 (PAM) 时,Cas9 等 Cas 核酸酶可以在与其结合的引导 RNA (gRNA) 的 20-nt 间隔区序列互补的序列目标中引入 DNA 双链断裂。gRNA 可以作为包含 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 的间隔物的双链体提供。或者作为单个 gRNA (sgRNA),其中 crRNA 和 tracrRNA 通过人工环融合。
因此,gRNA 由目标特异性间隔区和恒定部分组成,通常由不同的基序组成,包括连接、第一和第二发夹。
RCPRC进化人类学研究所的科学家证明,目标的低切割效率可能是由于某些间隔序列引起的非规范 gRNA 二级结构(“错误折叠”)。
他们开发了一种引导 RNA (gRNA) 骨架,包含一个细长的超稳定(第一)发夹,它不与 Cas 酶相互作用,但会锁定整个 gRNA 的二级结构,以抑制这种错误折叠,从而加强和启用正确的碱基在其他失败的 gRNA 中,间隔序列与其目标序列配对。
这个G en O me-Editing- Locked- Design (GOLD- tracr /gRNA)无论间隔序列组成如何,都可以进行稳健的基因组编辑。通过引入无偏见的 gRNA 文库,它可以帮助它们在 CRISPR 敲除、激活或抑制筛选中更有效地切割能力,而不会损害一般表现良好的 gRNA。
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